CRISPR/Cas行使编辑功能依赖于识别靶标DNA上的特殊序列（简称PAM）。PAM序列的复杂程度决定了可编辑位点的上限。但在实际应用中，常常受限于编辑位点没有PAM序列，导致无法进行有效编辑。已知的Cas蛋白主要通过和PAM序列形成多个氢键，进而弯曲并打开双链DNA，最终切割DNA (Sternberg et al., 2014)。DNA在真核细胞里具有不同的拓扑结构，比如经典的右手螺旋B-form和特殊的左手螺旋Z-form。转录过程中,因为打开DNA双链引起扭力变化，导致转录上游和转录下游的DNA分别形成负超螺旋和正超螺旋构象。研究表明，因不同拓扑结构的DNA其扭力不同，导致打开双链难易程度也不同(Stolz et al., 2019)。然而，DNA拓扑结构是否可以在调节PAM识别和结合中发挥作用仍然未知。
2022年10月21日，武汉大学医学研究院、免疫与代谢前沿科学中心和武汉大学中南医院的张楹团队在Molecular Cell杂志上发表了题为DNA topology regulates PAM-Cas9 interaction and DNA unwinding to enable near PAMless cleavage by thermophilic Cas9的论文。报道了来源于嗜热菌、天然具有广谱PAM且高活力的AtCas9。AtCas9的PAM为N4CNNN和N4RNNA (R=A或G), 可以覆盖68%的基因组序列。研究揭示其和PAM互作的新机制，发现除了经典氢键互作之外，AtCas9的特殊loop结构可嵌入DNA大沟，且其嵌合度受DNA构象调控，实现对特定DNA构象进行不依赖PAM的任意切割。此外，虽然AtCas9的最适酶活温度是55℃，AtCas9可在哺乳动物细胞中表现出高效的碱基编辑活力，在多个位点达到60%的编辑效率。GUIDE-seq脱靶分析显示,相比于SpCas9, AtCas9并没有明显的脱靶现象。论文首次报道天然具有广谱PAM的新型基因编辑工具，且可在细菌中不依赖PAM序列切割质粒，在真核细胞具备高效编辑活力。
首先，作者通过阳性筛选和阴性筛选两个方法分别对AtCas9的PAM进行鉴定，发现当底物是负超螺旋（质粒）构象时，没有任何序列偏好性；当底物是线性构象时（B-form）,在第5位有强烈的C/A/G序列富集（图1）。当将PAM的第5位C突变为T时，AtCas9完全丧失了对线性DNA的切割但却不影响其对松散构象DNA（负超螺旋和Z-form）的切割活性。另外，将AtCas9表达系统构建到大肠杆菌中，并转入16种包含PAM或非PAM的质粒构象底物时， AtCas9对质粒底物展现出不依赖PAM的切割活性。
图1.PAM偏好性。当底物是质粒构象时，没有序列偏好性；当底物是线性或开环构象时，第五位有C/A/G的富集。
为了剖析DNA拓扑结构如何影响PAM识别，作者探究了拓扑结构在调节Cas9结合中的作用。不同于SpCas9，AtCas9在RNP高浓度下仍可结合PAM突变的线性DNA。为了直接验证DNA构象可以直接影响PAM-Cas9的互作，作者利用不含有protospacer的多个串联突变PAM底物进行竞争实验。结果表明，松散构象的突变PAM串联体可高效竞争含有PAM的完美底物，提示DNA拓扑结构可直接影响AtCas9蛋白和PAM的互作。为了揭示PAM-AtCas9相互作用机制，作者利用AlphaFold2和SWISS模型分别预测AtCas9的结构，发现AtCas9蛋白有一特殊loop结构域，可紧密地嵌入DNA大沟中，作为支撑Cas9-DNA互作的锚点。同时，loop结构中Asp1089可以与PAM上C5形成氢键，提供了序列特异性。这些结果表明，独特的AtCas9-PAM相互作用模式和 DNA 拓扑结构共同决定了 AtCas9 最终对底物的切割活性。
为了验证嗜热AtCas9在哺乳动物细胞中是否有活性，研究者对AtCas9进行一系列改进，在EGFP位点中达到60%的切割效率。利用GUIDE-Seq检测AtCas9的脱靶效应，发现AtCas9的脱靶事件远低于SpRY（一种近乎无PAM的SpCas9变体）。考虑到 PAM 选择对碱基编辑器的高度限制，作者进一步探索了AtCas9在碱基编辑中的应用。AtCas9-BE3可以对超螺旋质粒底物进行C到T的单碱基编辑，在含有PAM （CNNN和RNNA）的底物中平均编辑效率达到46%。在内源性基因位点中，AtCas9-BE3可产生与SpRY-BE3相当的单碱基编辑效率，平均编辑效率为30.91%。同样的，AtCas9-ABE8e也可在内源性基因位点发挥功能，平均编辑效率为16.72%。
小结：作者发现了天然具有广谱PAM的新型Cas9（AtCas9），且DNA拓扑结构可调节Cas9与PAM的识别。AtCas9的PAM识别结构域中的loop motif可作为额外的锚定点启动DNA解旋，其中Asp1089既可与PAM第5位C发生氢键相互作用，又与T存在空间排斥力，揭示了一种全新Cas9-PAM相互作用机制。另外，AtCas9能够介导哺乳动物基因组中的有效碱基转换，其对松散构象的广谱 PAM 编辑为基因组编辑家族增加了一个新工具。
武汉大学医学研究院研究生史亚晶、段敏以及云南师范大学丁俊美为本文共同第一作者，武汉大学医学研究院张楹教授为唯一通讯作者。感谢马赛诸塞医学院Erik Sontheimer教授、武汉大学殷昊教授、普颖颖教授对本项研究提供帮助。
论文全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276522009534?via%3Dihub
参考文献
Sternberg, S.H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E.C., and Doudna, J.A. (2014). DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature 507, 62-67. 10.1038/nature13011.
Stolz, R., Sulthana, S., Hartono, S.R., Malig, M., Benham, C.J., and Chedin, F. (2019). Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proc Natl Acad Sci U S A 116, 6260-6269. 10.1073/pnas.1819476116.
水中洛神起舞:翩若惊鸿，婉若游龙
洛神比拟AtCas9, 琵琶比拟PAM，彩带代表双链DNA。当彩带紧密缠绕时，洛神需借助琵琶在彩带中翩翩起舞；当彩带松散缠绕时，洛神自由飞舞跳跃于彩带之中。
